EMLÉKEZTETŐ: DNS, gének és fehérjék


A dezoxiribonukleinsav (DNS) alkotórészei 

1868. Meischer gennysejtek magjából izolálja a foszfor tartalmú nuklein-t
4 bázis alkotja: adenin (A), citozin (C), guanin (G), timin (T)

bázis+ deoxiribóz -> nukleozid + foszfát csoport (foszfodiészter kötés) -> nukleotid:

purinok:
deoxiadenozin 5'-monofoszfát - dAMP, deoxiguanozin 5'-monofoszfát - dGMP

pirimidinek:
deoxicitidin 5'-monofoszfát - dCMP, deoxitimidin 5'-monofoszfát - dTMP

Szabályos szerkezet: Erwin Chargaff meghatározta különböző élőlényekből származó DNS mintákban a bázisok arányát (11-1. táblázat) és bizonyos törvényszerűségeket fedezett fel, de ezek okára csak a szerkezet megfejtése adott magyarázatot (1953. James D. Watson és Francis Crick).
  • Chargaff szabályok
          • 1. T+C (pirimidinek) = A+G (purinok)
          2. A = T és G = C (A+T nem = G+C)
11-1 tálázat: A bázisok aránya a különböző élőlényekből izolált DNS mintákban.

A DNS szerkezete :

Röntgendiffrakciós szerkezetvizsgálatok: Rosalind Franklin, Maurice Wilkins az 1950 körül kezdték a kikristályosított DNS röntgendifrakciós szerkezetelemzését. Az eredmények (röntgendiffrakciós felvételek) kiértékelhetősége erősen függött a kristályosítás sikerétől. Franklin egyre jobb felvételeket készített, melyek igazolták a molekula helikális szerkezetét.

A Watson - Crick modell: a DNS szerkezetének megfejtéséhez James D. Watson és Francis Crick 1950-ben fogott neki, mert meg voltak róla győződve, hogy a DNS az örökítő anyag és a szerkezet megfejtése alapvetően rávilágít az öröklődés molekuláris mechanizmusára.

Riválisuk Linus Pauling volt, aki elsősorban a fehérjék szerkezetét kutatta és akkoriban állította fel és később részletesen igazolta is munkatársaival, hogy a fehérjék felépítésében lényeges szerepe van az alfa-héix szerkezetnek.



A két rivális csoport több modellt állított fel, melyek rövid időn belül tévesnek bizonyultak. Végül a versenyt Watson és Crick (meg Franklin és Wilkins) nyerték meg 1953-ban, amikor közölték híres, egy oldalas cikküket a NATURE folyóiratban. 1962-ben Nobel díjjal jutalmazták ezt az "egy oldalnyi" elméleti megfontolást.

A sikerhez alapvetően három lépcső vezetett : 
  • modellépítés , elméleti térszerkezeti megfontolások
  • röntgendiffrakciós mérések értelmezése (helix, - Linus Pauling - alfa-hélix)
  • a Chargaff szabályok ismerete és értelmezése




     





Szerkezeti jellemzők és következményeik:  
  • kettős hélix, melyben a két szálon lévő bázisok egymással H-hidak segítségével kapcsolódnak: A:T - 2db, G:C - 3 db H-híd
  • egymással szemben komplementer bázispárok, A:T és G:C helyezkednek el, így a párosok térkitöltése megegyezik.
  • replikáció (másolás) lehetősége,
  • genetikai kód - szálon belül nem kötött a sorrend = nem monoton !
  • egy "csavarmenet" 34 A, 10 bázispár / 1 csavar, 36o / bp
  • lefutás antiparalel, 5' - 3' irány
  • háromdimenziós szerkezet - nagy és kis árok, (major, minor groove)

Az  5'-3' irány
A DNS-polimer irányultságát a dezoxiribóz szénatomjainak számozása szerint 5' és 3' jelekkel  jellemezzük (piros nyilak). A polimerhez az újabb deoxiribonukleozid-monofoszfát egység  a DNS polimeráz segítségével a 3' végen csatlakozik egy  deoxiribonukleozid-trifoszfát (dNTP) egység felhasználásával. Kék szín jelöli a cukor-foszfát gerincbe beépülő foszfát csoportot. Tehát a DNS-szál szintézise 5'-3' irányban történik, a  templát szál által meghatározott (komplementer) bázisok beépítésével.

A másolás lehetősége a szerkezeti jellemzők felismerése után szinte magától értetődő volt, amit a híres Nature cikk utolsó mondata jezett:

"It has not escaped our notice that the specific pairing we have postulated immediately suggests a possible copying mechanism for the genetic material."

Hogyan kódolt a genetikai információ?

Genetikai kísérletekből már ismert volt, hogy a DNS-szálon a gének, mint könyvben a mondatok, egymást követve helyezkednek el. Az is nyilvánvaló volt, hogy a gének legnagyobb része különböző fehérjék (pl. enzimek) szerkezetét határozza meg. A kérdés most már az volt, hogy ez milyen kód alapján rögzített a DNS-molekulában? A DNS szerkezetének felvázolása után a molekuláris biológia és később a bioinformatika szempontjából a következő fontos lépés a genetikai kód megfejtése volt.

Felfedezték, hogy a DNS bizonyos szakaszai RNS molekulákká íródnak át (transzkripció), és ezek nagy része (mRNS) a különböző fehérjék bioszintézisét határozzák meg. A genetikai üzenet nukleinsavból fehérjévé alakulása (lefordítás, transzláció) a riboszómák segítségével valósul meg. Főként biokémiai és részben genetikai kísérletek révén  sikerült kideríteni, hogy a fehérjéket felépítő 20 aminosavat a DNS-szálon hárombetűs kódok határozzák meg. Mivel  4 betű 3 egymást követő helyen összesen 64 lehetséges kombinációban fordulhat elő (4x4x4 = 43), ezért egy aminosavat több különböző kodon is jelenthet. Ezt kísérletekkel igazolták is. Tehát a kódszótár redundáns.


A kódszótár: a DNS-ben található T helyett U szerepel, mert az RNS molekulákban, és így a mRNS esetében is, uracil található a timin helyett.

A kísérletek szerint egy, a fehérjeszintézis (transzláció) kezdőpontját meghatározó "startkodon" van (ATG), ami metionint jelent. Ezen kívül három, transzláció végét jelző "stopkodon" alakult ki (TAA, TGA, TAG). Egy aminosavat maximum hat különböző kodon jelenthet (pl: Leu - lásd az ábrát).

Hol kezdődik?
Egy betűsorban nagyon sok helyen fordulhat elő véletlenül is az ATG kombináció. A legtöbbje nem kezdőkodon. Hogyan ismerhető fel (a sejt számára is) a kezdőpont?

A DNS-szekvenciában nemcsak a fehérjék szerkezete (kódoló régió), hanem a gén kezdete és vége, és működésének (génexpresszó) mikéntje is meghatározott.

A gén elsődlegesen egy RNS-molekula bioszintézisét határozza meg. A bioszintézis (transzkripció) az RNS-polimerázok által valósul meg. Azt, hogy honnan és mikor kezdje munkáját az RNS polimeráz a kódoló régió előtt található jelek (DNS-szekvenciák) mutatják meg. Ez a gén promoter régiója, amely tartalmazza az RNS-polimeráz kötőhelyét és különböző, a gén működését (transzkripcióját) befolyásoló szabályozó fehérjék kötőhelyét is.

Hol végződik?
Az RNS molekula szintézisének befejezését (transzkripció termináció) szintén a DNS-szekvenciában kódolt jelek határozzák meg. Ez is része a génnek.

Génexpresszó

A DNS szekvenciájának kísérletes meghatározása a molekuláris biológia módszereinek fejlődésével vált lehetővé.
A szekvencia meghatározás ma is használatos módszerét Frederick Sanger dolgozta ki.

Sok szabályozó rész bázissorrendjének meghatározása tette lehetővé a szekvenciák összehasonlítását, a jellegzetes részek (szignálok) megtalálását. Ez már a bioinformatika feladatát is képezi.


A "DNS szekvenálás"
Maxam Gilbert dolgozta ki a DNS-szekvencia meghatározás kémiai módszerét. A mai napig alkalmazott eljárás Frederick Sanger "didezoxi láncterminációs" módszerén alapszik. Munkájukat Nobel-díjjal jutalmazták. Sanger megoldása irányított DNS-bioszintézis kémcsőben, amely során izotóppal vagy fluoreszcens molekulákkal jelölik a keletkező új szálat. Poliakrilamid gélelektroforézissel történő elválasztás után elolvasható a pontos betűsorrend. A szekvencia meghatározását ma már automata szekvenálókészülékek, a részszekvenciák összeszerelését számítógépek segítik.

A leolvasási keret

Egy adott DNS-szakasz szekvenciáját 5'-3' irányban írjuk fel. Elég csak a "felső" szál  szekvenciáját megadni, hiszen az pontosan meghatározza a vele kapcsolódó, komplementer "alsó" szál  bázissorrendjét.
Egy DNS-szál három lehetséges leolvasási (fordítási) keret szerint tartalmazhat információt egy fehérje aminosavszekvenciáját illetően.
  

5'
GCATGCACGGCGGCTTCGGCCGAATGACGGCGAAAACTCTTGCGGCCTGGGAAATCCGGTAGCCGCGGACGCGGAGTTAC
CAATTTGCCAGGCATTATCGAGACCATTTCGCTGATCGTGTCTTCGCTGGCGACGACGACGGCCCTGGCCAACGCGCTCT
ACCTCGGCACGTCGGCGCTGCTTTACGGCGGCATCGCGGCCGGAGCTCTAGCGCTGCAGGGCGCGTTCGCTTCCAAGCCA
GCCGTGCCGAAGCCAGACGACGGCAGCTATAACCTGAAACAGAGCGTTCCGTCGCTGCCTTACGTGCTCGGGCGCGTCAA
GAAGGGTAGCGATTACGTCTTTCTAGAGGAGAAGGGCGGCAAGGCGCACCACATCATGGTGTGGGCGGGGCATCGCATAC
ATGCGTTCGTCTCCCACTACCTGCATGACGAAAAGGCCACCCTGAACGTCGACGGTGGCGTGACCGAGCCAGGCCATTAC
GACAAGGACGGTGTCAGCTTCGTTCACATCAAGACGAAGCTCGGGCTGAACGCCGAAACGGCATATTCCGACGTAGTTAC
CGCCTTTCCGACCATTTGGGACAACAACTGCCGCGGAGATGGACTCGCGTCTGTCTACATGACGTGCAGGACTGTCGATC
AGAAAGACTTTCTGGATGTCTACCCGAACCAGATGCCGGAGCATTCGGCGGTTGGTGACGGCGCGCTTCTGTATGATCCG
CGCAAAGACAGCACGCAGGGCGGATCCGGGGCGCACCGCTACAACAACCCACTGACGTGGGAGTTCTCGAGCAATCTGGC
GCTGATGCGCCTATGGCACCTCTGCCACCCCGTCGGCGGCAAGATGGCCTACGAGAACATGTATCTGCCCGACTGGGCGA
ATGCCGCTAACGTCTGTGACCAGAACGTCACGAACCGCAGCGGGGCAACGGAGAAGCGCTACCACGGCGGCTTCTGGTTC
CGCGCCAGCAATGACCCGATCGAAGTCGGGCGCATCATGGACGAAGCCGCCGAGATCGTTGTCTACGAGCGCGCCGACGG
CAAGATCGGCGTCCATGCCGGTGAGTTCGTCGCGCCCGATGTGCGGCTGGAGGCCAAGAGCATCTACAGCATCCGCGTCG
ACAAGAATAAGCGGCGCGCGAACACTGTGCTTGGCGTGCGCGGGCGGTACGTCAATACGGCCAAGGACTACATCACTGAA
GACGCCGCGATATACGGCGACCCGTATGCTGTCGTCGACGACAGCACGGAGCGCACGCGGACCTTCGACAATGCGGCAAT
CCAGAGCCACAACCACTGCCAGCGCAAGCAGAAGTTGACGTTTGTCAGGGCGAACGCTCGGCGCGTCTCGGTGGTCGCGG
ACTACACGGCAGACGGCGTTAGGGATATCCCTTACCGGCGCTTCGTGACGGTGCACTACCCTAGCCGGGGGCTGGCCGAA
GCCGTTGTTGAAATCACATCGAGCGTGACGATTGATCTGCGCAACATGCGCATTTCGTTCTCCGGCATTATCGTGTCACC
GAGCCTGTACGCCTTCAACGCCGCAACGGAGGAGGGCGAGCCTGGCGAGTCCGTCGAGCCATTGCCCGATGAGGGCGTCC
CGGTCCCGACGGGCTTCGTTCCGACGATCCAAACGGAAGTCGTTTCTGGCGGCGCCACGGCGGCATTCATCAATGCGACG
TGGACCTTCGTCGACGACACGCTGACTTACGAGCTCGAATACGACCGCACCAGCGGCTCGACGGGCGTGCAGTCGGTGTT
TTCAGTTGCTGGCGATACGCAGGTTCGTTCCGGCTATCTCGTCGACGGCGAGGAATACCGCGTCAGGCTGAGAGCATGGG
GCGGCGGCACGAAGTCCGAGTGGACCGATTACGTGCTTCTGACTGCTACGGCGGATCCGGTTGCGCCGGGGGCTGTTACG
GCGGTCAGCGTGGATGTGTCGACGCCGTCTGAAGCCGAGTTTGGCTGGACCGCGCCGAACAGCGCCAACTACTTCGCCTG
CCGCATTTACATCAACACCGTCGACAACCTGGGAACGGCAACGCTCGCGGCGACCGAATACGGGCCGCCTAGCGCGACCG
ACTTGCGCGTCGTCACGTCGCTCGCCGCCGGCACCTATTACGGCTGGCTTCGGTCGATCAACCCATCTGGCATCGCCGGT
ACGGCGGTAGCGACTGGGGCGTTTGTCGTGACGTAACGCCACCCGCCGACAGCACAATCTGGATTTTGCAGCCCGCCCTC
GCGCGGGCTTTTTCTTTACATGGAGCAAGCATGGCCATCACCGCAGCAGAGGCCT-3'

 Ha nem tudjuk, hogy honnan kezdjük a bázistripletek dekódolását, akkor mindhárom esetet meg kell vizsgálnunk. Ráadásul a komplementer szálak mindegyike lehet kódoló szál, ezért összesen hat lehetséges leolvasási keretet kell számításba venni, ha egy fehérje kódoló keretét keressük.

A fenti szekvenciát egy irányból három helyről kezdhetjük kodonokra bontani, és azután a kodonoknak megfelelő aminosavakat egymás után írni :
az 1. keretben a kezdő kodon  GCA (Ala),
a  2. keretben CAT (His),
a 3. keretben  ATG (Met). Mindhárom keret fordítása egyedi amonosavsorrendet eredményez.

A kodonok lefordítását egy adott kezdőponttól addíg folytathatjuk, ameddig stopkodon nem következik. Ez a lehetséges kódoló keret és egyben a lehetséges kódolt fehérje végét jelenti. Egy  nyitott leolvasási keret (open reading frame vagy ORF) tehát stopkodontól stopkodonig terjed. Ez a  maximális fehérjekódoló kapacitást jelenti. Mivel általában a kezdő kodon ATG, ezért  első megközelítésben helyesen járunk el, ha az adott szakasz által meghatározott fehéreszekvenciát az első ATG kodontól kezdődően írjuk fel. (Sok kivétel is előfordul!)

A fenti szekvencia összes lehetséges nyitott leolvasási keretét (ORF) mutatja a hat lehetséges keretben (mindkét DNS-szálon)  az alsó ábra. A leghosszabb ORF  az 1. keretben található. Ezt a kódoló szekvenciarészletet jelölik a szekvenciában a piros ill. sárga betűk. A kezdő ATG után ugyanabban a leolvasási keretben közel 1800 bp után következik csak egy TAA (UAA) stopkodon.




Az eddig elmondott szabályok szerint csak a prokarióta DNS-szekvencián tudjuk minden nehézség nélkül megtalálni a feltételezett kódoló régiókat. Ugyanis a prokarióta gének esetében a fehérje kódoló régiók nem megszakítottak.
Az eukarióta gén (genomikus szekvencia) általában fehérje szakaszokat kódoló részekből (exonok) és nem kódoló, közbeékelt DNS-szekvenciákból (intronok) áll.

A mRNS szintézis (transzkripció) során a közbeékelt szekvenciák is lemásolódnak (pre-mRNS), de ezek később a mRNS érés  folyamatában kivágódnak, még a sejtmagban.

Az exonok épülnek össze érett mRNS-sé, ami már - a prokarióta génhez hasonlóan - egyetlen egybefüggő leolvasási keretet tartalmaz.  (cDNS szekvencia).

Ebből következően a genomikus szekvencia számítógépes elemzése során azokat a jeleket is meg kell találni, amelyek az exon-intron határokat jelölik ki. Így rekonstruálni tudjuk a teljes leolvasási keretet. A génhez tartozó cDNS-szekvencia kísérletes meghatározása igazolhatja a számítógépes  elemzés eredményét.


A fehérjék aminosavakból  felépülő polimerek. Az egyes építőköveket peptidkötés tartja össze. A legtöbb fehérje a megfelelő génről keletkezett mRNS irányítása alatt a riboszómákon készül el (transzláció).
A fehérjék elsődleges szerkezete az aminosavsorrend. A fontos szekvenciarészletek  megkeresésében a bioinformatika is segítséget ad. A jellegzetes  részek fontos funkcionális elemek lehetnek. Enzim aktív centrumok,  DNS-kötő domén, ... stb.

A fehérjék másodlagos szerkezetét az egyes aminosavmaradékok közötti kölcsönhatások alakítják ki (hidrogén-hidak). Jellegzetes másodlagos szerkezet az alfa-hélix.

A harmadlagos szerkezet egy fehérjelánc teljes három dimenziós térszerkezetét jelenti.

A negyedleges szerkezet azt mutatja, hogy egy funkcionális egység (pl. enzim) milyen polipeptid láncokból áll össze.